Nat Commun | AAV基因治疗在CNS中引发的剂量依赖性不良事件与DNA损伤反应依赖性促炎信号传导有关_研究_毒性_细胞

研究概述

2025年4月18日，意大利米兰圣拉斐尔电镜研究所基因治疗中心的Anna Kajaste-Rudnitski教授团队在Nature Communications期刊发表标题为“AAV vectors trigger DNA damage response-dependent pro-inflammatory signalling in human iPSC-derived CNS models and mouse brain”的研究论文。该研究主要探讨了腺相关病毒（AAV）载体在人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的中枢神经系统（CNS）模型和小鼠大脑中引发的依赖于DNA损伤响应的促炎信号通路，揭示了AAV载体基因治疗可能引发神经毒性的内在免疫机制，并提出了潜在的干预策略以提高CNS靶向AAV基因治疗的安全性。

导读

基因治疗中使用的腺相关病毒（AAV）载体已成为治疗遗传性神经退行性和神经肌肉疾病的一种有前景的治疗选择，而这些疾病目前尚无治愈方法。然而，突破血脑屏障、实现广泛的中枢神经系统（CNS）转导以及挽救所有受影响的区域仍然是一个挑战，这需要在体内系统性或局部性地使用高剂量的AAV载体，而这种高剂量可能会引发细胞毒性免疫反应。此外，在这些高剂量下，静脉注射AAV载体与一些系统性不良事件和死亡率有关，这些事件最近在X连锁肌管性肌病（MTM）和杜氏肌营养不良症（DMD）的临床试验中有所报道，通常是由于在非靶向器官（如肝脏）中的毒性或血栓性微血管病引起的，这突显了提高该技术的安全性和有效性的重要性。

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AAV介导的CNS基因传递在许多临床试验中显示出总体的临床安全性和有效性。然而，非人灵长类动物（NHP）的研究和临床试验揭示了AAV载体在中枢神经系统和周围神经系统中均能诱导剂量依赖性的毒性，表现为脑实质或背根神经节（DRG）中的神经元丢失。此外，在针对晚发性婴儿巴顿病的临床试验中，直接向大脑注射AAV后也报告了神经系统症状。尽管在某些情况下，观察到的毒性被认为与包装有毒载荷有关，可以通过改进生产工艺来预防，但在大多数研究中，导致毒性的原因仍然不清楚，这突显了更好地理解这些神经系统症状发生机制的必要性。

由于神经系统组织的有限可及性以及在患者中监测免疫反应的挑战（大多仅限于磁共振成像[MRI]），因此很难研究和预测AAV转导在该组织中引起的免疫反应和毒性，尤其是在症状尚未临床明显时。值得注意的是，现有的NHP报告中没有发现通常在肝脏或肌肉基因转移后观察到的细胞毒性T细胞反应的证据。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）支持努力识别AAV介导的神经毒性的原因，并开发监测和缓解这些毒性的策略。

目前大多数关于AAV相关不良事件的研究集中在由载体衣壳引发的适应性免疫反应、外周先天免疫细胞上Toll样受体（TLRs）对衣壳和基因组的感应作用以及体液和补体反应。然而，AAV转导对目标细胞内在先天免疫机制的影响，如核酸感应、细胞毒性和组织炎症，仍然知之甚少。在体外基因转移的背景下，已有研究报道了目标细胞毒性与内在先天感应之间的联系。重要的是，细胞内在的抗病毒机制可以促进炎症的建立、导致宿主细胞毒性或限制病毒载体的转导。本研究和其他研究之前已表明，AAV载体可以诱导造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的DNA损伤反应（DDR），从而影响这些细胞在体内的转导效率、存活能力和植入能力。然而，DDR和先天信号传导对AAV介导的体内基因转移的安全性和有效性的影响仍有待研究。

抗病毒防御机制具有物种和细胞类型特异性，神经元具有特定的免疫机制，且病毒载体在HSPCs中激活的信号通路在人类和小鼠细胞之间存在差异。同样，不同AAV血清型的组织趋向性和转导效率在不同物种之间也有所不同。为了研究AAV介导的神经毒性在相关人类CNS细胞类型中的机制，本研究利用人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术，研究了AAV转导对不同神经细胞类型中细胞自主信号传导和先天免疫的影响。通过批量和单细胞转录组学以及功能实验，本研究发现AAV基因组在hiPSC衍生的神经元和胶质细胞中早期诱导了依赖于p53的DDR和细胞死亡信号，随后是依赖于转基因表达的促炎和I型干扰素（IFN）信号，这些信号在2D培养和3D脑类器官中均有观察到。在体内实验中，通过向小鼠脑内注射AAV9（一种针对CNS的临床相关血清型）也证实了类似的DDR激活和促炎反应。通过阻断p53下游的STING或IL-1R信号传导，可以减少转导相关的神经毒性，而I型IFN信号似乎依赖于线粒体抗病毒信号（MAVS）传感器。最后，概念验证实验表明，p53和STING抑制可以调节体内和体外的星形胶质细胞激活。如果这些发现在未来的临床研究中得到证实，那么这些发现将为开发更安全的针对CNS的AAV基因治疗开辟新的途径。

研究结果

1. AAV转导在hiPSC衍生的神经元和星形胶质细胞中触发DNA损伤反应和细胞死亡

作者研究了AAV载体在hiPSC衍生的神经元和星形胶质细胞中的转导效果及其诱导的信号传导。实验中，hiPSC衍生的神经元和星形胶质细胞分别被不同血清型的AAV载体转染，这些载体携带绿色荧光蛋白（GFP）基因，由CAG启动子控制。结果显示，AAV2和AAV6在转染效率和诱导转录变化方面表现最为显著（图1）。

诱导的基因主要与p53激活、TNFα信号传导和炎症反应相关，而下调的基因多与细胞分裂相关，表明了DNA损伤反应的发生。值得注意的是，空的AAV9衣壳未诱导显著的转录变化，而完整的AAV9载体则显著诱导了相关基因的表达，说明载体基因组是触发信号传导的关键因素。

图1. AAV载体在hiPSC衍生的神经元和星形胶质细胞中诱导了依赖于转染的转录变化。

在进一步的实验中，作者发现完整AAV9载体转导的hiPSC衍生神经元中，DNA损伤标记物（如p-γH2AX）和细胞死亡标记物（如cC3）显著增加，而空AAV9载体转染的细胞中未观察到这种现象（图2A-C）。具体而言，p-γH2AX的磷酸化形式显著增加，表明DNA损伤部位成功招募了DNA修复蛋白；同时，cC3的裂解形式也显著增加，表明细胞死亡的发生。这些结果表明AAV转染的DNA损伤和毒性效应依赖于载体基因组的存在。

图2. AAV9介导的转染在hiPSC衍生的神经元中激活了功能性DNA损伤反应和凋亡。

这些结果共同表明，AAV转染以载体基因组依赖的方式在hiPSC衍生的神经细胞中触发DNA损伤信号传导和随后的毒性。

2. 单细胞转录组学揭示AAV9在混合2D培养和3D脑类器官中早期激活p53，随后引发炎症和干扰素信号传导

作者利用AAV9转染hiPSC衍生的混合2D培养，包含不同成熟阶段的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞（图3A）。单细胞RNA测序（scRNAseq）分析显示，星形胶质细胞和少突胶质细胞的GFP表达高于神经元，表明这些细胞对AAV9的趋向性更高（图3D）。转染后第2天和第4天的信号通路分析显示，星形胶质细胞和少突胶质细胞对载体反应最为强烈，表现为p53通路的早期激活，随后是炎症和细胞应激标志物的上调（图3E）。

图3. 混合神经培养的单细胞转录组学揭示了先天免疫途径的时间和细胞类型依赖性激活。

进一步研究中，作者在培养150天的3D人脑类器官中评估了AAV9转染的影响，并在转染后第2天和第5天进行了检测（图4A）。单细胞转录组学分析确认了与2D培养相似的细胞组成和GFP分布，且星形胶质细胞和少突胶质细胞的GFP表达更高（图4B–D）。

3D脑类器官的转染同样引发了时间依赖性的反应，表现为p53通路的早期激活、代谢变化，随后是炎症和I型干扰素（IFN）反应的诱导，以及细胞应激通路（如凋亡和未折叠蛋白反应）的激活（图4E）。这些结果表明，在复杂的3D脑类器官中，AAV9转导首先激活了DDR，随后引发了I型干扰素和炎症反应。

图4. AAV转染在3D类器官中引发了依赖于时间的DNA损伤和炎症反应的激活。

3. 炎症特征由不同AAV血清型和转基因诱导，并依赖于转基因表达

作者通过AAV9和Spk100血清型转染脑类器官，研究了载体基因组和转基因表达对信号传导的影响（图5A）。实验中使用了CAG启动子（广泛表达）和hAAT启动子（在CNS细胞中不表达）控制的GFP转基因。结果显示，仅载体基因组（hAAT启动子）即可引发DNA损伤反应，而完整的转基因表达（CAG启动子）进一步增强了促炎和I型干扰素信号（图5B–D）。

在转染后第5天的单细胞RNA测序分析中，非表达型Spk100-hAAT-GFP载体的信号较弱，主要限于氧化磷酸化、p53和DNA修复反应（图5B）。而CAG启动子驱动的载体在星形胶质细胞（图5B）和少突胶质细胞（图5C）中引发了更强的炎症和细胞应激反应。特别是少突胶质细胞表现出更高的反应性，表明其对AAV转染更为敏感。此外，GAA转基因（临床上相关）的反应最为显著，表明不同转基因序列的特性可能调节信号传导的强度（图5D）。

这些结果表明，AAV转染在人类CNS细胞中首先激活p53介导的DNA损伤反应，随后的炎症和I型干扰素反应则依赖于转基因的表达。

图5. 不同AAV血清型和转基因诱导炎症特征，并依赖于转基因的表达。

4. AAV9介导的CNS转染在体内诱导促炎和细胞应激信号传导

为了评估AAV9在体内的免疫反应，作者对成年雄性小鼠的纹状体进行了AAV9-CAG-GFP或载体的双侧注射，并在注射后28天进行处死分析（图6A）。通过单核RNA测序（snRNAseq）分析，发现小鼠脑内不同细胞类型（神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）的组成未因处理而产生显著差异（图6B、C）。

然而，GFP mRNA在星形胶质细胞和少突胶质细胞中的分布高于神经元（图6D）。通路分析显示，与hiPSC衍生的CNS模型类似，小鼠体内也诱导了I型和II型干扰素反应、氧化磷酸化以及与DNA损伤反应相关的多个通路（图6E）。

图6. AAV9介导的中枢神经系统转染在体内诱导促炎信号传导。

为了进一步确认体内DNA损伤信号的激活，作者对接受AAV9-CAG-GFP或载体注射的小鼠纹状体进行了免疫荧光共定位染色分析（图7）。结果显示，AAV9注射的小鼠脑切片中形成了p-γH2AX焦点，这些焦点主要与NeuN+神经元共定位，表明神经元对DNA损伤反应更为敏感。此外，AAV9注射的小鼠还表现出GFAP+Sox9+星形胶质细胞和Iba1+小胶质细胞的增加，以及小胶质细胞激活标记物（如Galectin-340和Gasdermin D）的表达。这些结果表明，AAV9转染在体内引发了胶质细胞增生和免疫细胞的募集。

总体而言，这些结果揭示了AAV9在体内CNS中引发的先天信号通路激活、胶质细胞增生和DNA损伤反应，进一步验证了hiPSC衍生的CNS细胞模型在研究AAV介导的神经毒性中的相关性。

图7. AAV9介导的中枢神经系统（CNS）转染在体内诱导功能性DNA损伤反应和胶质细胞增生。

5. AAV诱导的促炎信号传导和凋亡依赖于p53

作者研究了AAV转染引发的信号通路中的细胞感应器。转录组分析显示，AAV转染在人类和小鼠CNS细胞中诱导了抗病毒I型干扰素（IFN）信号（图3、4、6）。由于不同启动子的CpG含量差异可能影响信号传导，作者测试了TLR9抑制剂对hiPSC衍生星形胶质细胞的影响，但未发现TLR9阻断对AAV诱导的信号有显著影响。此外，携带修饰TLR9抑制序列的AAV2载体也无法降低促炎信号。这些结果表明，在hiPSC衍生的神经细胞中，TLR9并非主要的先天信号介质。

作者进一步研究了RNA感应的作用，通过MAVS基因敲除发现，MAVS缺失并未影响p53或细胞因子反应，但显著降低了I型干扰素刺激基因（ISGs）的表达，表明MAVS介导的RNA感应特异性地驱动AAV诱导的I型IFN反应，而非促炎信号。

为了测试p53在炎症反应中的作用，作者用携带p53抑制肽GSE56的慢病毒载体转染hiPSC衍生的星形胶质细胞，随后进行AAV2转染。结果显示，GSE56抑制了p21的诱导（图8B），部分阻止了ISGs的诱导（图8C），但完全消除了CXCL8和IL-1β的炎症信号（图8D）。此外，抑制p53还减轻了hiPSC衍生神经元中的AAV诱导毒性，表现为减少的凋亡细胞（图8E–G）和降低的LDH释放（图8H）。

综上所述，AAV转染在hiPSC衍生的CNS细胞中激活了依赖于RNA的I型IFN信号和与p53相关的神经毒性炎症。

图8. AAV诱导的促炎信号传导和凋亡依赖于p53。

6. AAV诱导的神经毒性可通过p53或cGAS/STING抑制来预防

作者测试了多种抑制剂，以探索预防AAV诱导毒性的策略。在hiPSC衍生的星形胶质细胞中，阻断cGAS-STING信号通路（使用H151）或IL-1R介导的炎症（使用Anakinra）能有效抑制促炎反应（图9A、C），但对p53依赖基因（如p21和GDF15）的表达无影响（图9B），表明这些信号通路在p53下游被激活。

这些抑制剂降低了促炎基因的表达，但不影响I型干扰素刺激基因（ISGs）的诱导（图9D），证实了炎症信号和I型IFN信号由不同的通路负责，分别由p53和MAVS调控。重要的是，阻断STING激活挽救了hiPSC衍生的神经元和混合神经胶质培养中的AAV诱导的细胞死亡（图9F–I）。

图9. AAV诱导的信号传导涉及p53下游的STING和IL-1R。

为了进一步评估p53对体内胶质细胞激活的影响，作者利用携带肝脏特异性hAAT启动子控制的FIX转基因的转录沉默载体，该载体在人CNS类器官中主要激活DNA损伤相关反应（图5）。

小鼠被注射该载体到纹状体，并同时腹腔注射p53、cGAS或STING的药理抑制剂，随后在注射后8周评估纹状体切片的胶质细胞增生情况。结果显示，接受载体注射的小鼠Iba1+和GFAP+细胞增加，但药理抑制p53或cGAS-STING通路可部分减少GFAP+细胞的存在，而对Iba1+细胞无影响。这些结果表明，即使在转基因表达低或缺失的情况下，AAV介导的CNS转导仍可激活胶质细胞增生，且这种反应并非GFP转基因所特有。通过药理抑制p53或cGAS-STING通路可部分调节胶质细胞增生，强调了载体基因组感应对于激活局部先天免疫细胞的重要性。

综上所述，这些结果表明，AAV介导的CNS细胞转导通过p53和MAVS分别介导的两种不同且独立的机制触发炎症和I型IFN反应，并确定STING介导的信号传导是预防p53依赖反应下游的AAV诱导神经毒性和胶质细胞增生的靶点。

讨论

本研究确定核酸感应是AAV转染CNS细胞时触发先天免疫和细胞死亡标记的原因，为理解可能引发亚临床至重度神经不良事件的分子机制提供了及时见解，这些事件似乎不涉及适应性细胞介导的免疫反应。

自20世纪90年代末以来，使用AAV载体进行临床试验的数量呈上升趋势，这得益于最初针对肝脏的各种代谢疾病进行静脉基因治疗所取得的令人鼓舞的结果。AAV载体因其多种血清型具有不同的组织趋向性，成为一种多功能工具，可用于靶向多个器官。然而，通过系统给药靶向CNS仍然具有挑战性，需要比靶向肝脏高10到100倍的载体剂量。在如此高的剂量下，AAV给药导致了多种毒性效应。最近对255项AAV临床试验的荟萃分析报告了8项试验中的11例患者死亡和30项临床暂停，其中18项是由于毒性发现，肝毒性、血栓性微血管病和神经毒性是最突出的严重不良事件。此外，由载体衣壳或转基因产物引发的免疫反应也可能影响治疗效果。

尽管CNS通常被认为是一个免疫豁免部位，但它包含自己的先天免疫细胞亚群，主要是小胶质细胞和星形胶质细胞，这些细胞可以在响应微生物侵害时促进先天免疫功能。此外，由病毒感染引起的神经元损伤可能会进一步促进胶质细胞的激活并导致神经毒性。先前的研究表明，抗原呈递细胞（APCs）对AAV衣壳和基因组的Toll样受体（TLR）感应参与了针对载体的适应性反应的建立。然而，很难解决这些先天免疫反应对人脑中AAV介导的基因传递的潜在贡献。

本研究使用多种血清型和转基因进行的研究表明，当使用含有完整基因组的载体时，AAV转导会在hiPSC衍生的神经元和胶质细胞中触发早期DNA损伤反应和凋亡标志，随后是促炎和I型干扰素信号。总体而言，观察到对特定通路有显著上调基因贡献的数量取决于每种血清型的转导水平，与传递更多的载体基因组相关，而不是衣壳组成，因为空衣壳没有信号。此外，与2D混合培养相比，3D体外模型中信号通路的上调似乎更为显著，表明AAV信号在人CNS细胞之间可能存在潜在的交叉对话和旁分泌效应。然而，这些差异也可能是由于脑类器官的转导时间更长或分化时间更长，从而产生更高的成熟阶段。或者，由于类器官外层细胞比内层细胞更容易被转导，MOI效应也可能解释部分差异，尽管单细胞分析显示2D和3D培养中GFP+细胞的百分比相似。

在本研究的体外实验中，DNA损伤反应是AAV转导后在人神经细胞中诱导的第一条通路，涉及多个p53依赖基因的激活和DDR焦点的形成。研究表明，DDR复合体的MRN组分被招募到载体基因组中治疗性表达盒两侧的病毒反向末端重复（ITR）区域。在本研究中，载体诱导的DDR在培养中持续长达5天，在体内至少持续28天。尽管AAV随时间环化，但ITR可能仍然被识别，尽管其以游离形式存在。事实上，向人胚胎干细胞微注射含有ITR序列的寡核苷酸足以在这些细胞中诱导DDR和凋亡。由于DNA损伤诱导的炎症通常与不同背景下衰老的建立有关，因此研究AAV载体基因组的游离持久性是否会导致CNS靶向治疗中的衰老将是一个有趣的方向。

几项研究报告了野生型AAV和重组AAV载体在不同细胞类型中诱导的DNA损伤反应。然而，在CNS背景下，相关研究一直缺失。AAV载体基因组已被观察到与HeLa或MRC5细胞核中的DNA损伤焦点共定位，并在体外激活人HSPCs中的p53介导的信号传导。然而，在某些细胞系（如2-OS、Huh7或A549）中未能观察到DDR基因的诱导，这强调了在评估AAV衍生的信号传导和毒性时使用相关模型的重要性。此外，p53在许多永生化细胞系中发生突变或改变，导致DDR发生改变。

在小鼠体内通过IPa注射确认了载体诱导的DDR焦点、炎症标志物和胶质细胞增生。这些结果表明，hiPSC衍生的CNS模型的研究结果与体内AAV载体触发的通路相关，并不仅仅是反映体外细胞对载体的高暴露。尽管如此，如诱导的GSEA术语数量所示，小鼠的载体信号总体上较低，这可能是由于在给定AAV剂量下实现的转导水平较低，或者是小鼠和人类之间存在不同的物种特异性反应。事实上，当涉及到AAV载体时，动物模型的研究往往对临床结果的预测性较差，这进一步支持了hiPSC衍生模型的使用。尽管存在这些差异，胶质细胞亚群主要通过诱导多个促炎和干扰素标志物来响应转导，而不会导致细胞死亡，而神经元对DNA损伤更为敏感，并且在不同的体外和体内模型中倾向于表现出凋亡标志。在罕见的遗传性自身炎症性神经退行性疾病Aicardi-Goutières综合征的背景下，也观察到神经元对炎症诱导的细胞死亡具有类似的易感性。

重要的是，炎症反应的激活并不局限于报告基因GFP，因为临床上相关的GAA转基因的表达也在3D脑类器官中显著改变了多个炎症通路。本研究的体外和体内实验表明，部分促炎信号依赖于p53，这表明DDR机制在检测病毒载体基因组和通过涉及下游STING和IL-1R通路激活的机制触发炎症信号方面发挥了作用。与这一假设一致的是，使用携带hAAT的载体进行CNS转导，主要在人脑类器官中触发p53依赖性标志物，诱导小鼠纹状体中一定程度的胶质细胞增生，这种增生可以通过抑制p53或通过cGAS-STING抑制来部分减轻。本研究还观察到，转基因的表达在诱导信号的幅度中发挥了作用，这一点通过在hiPSC衍生的3D脑类器官中进行的scRNAseq得到证实，这些类器官被普遍表达的CAG启动子或肝脏特异性hAAT启动子转导。先前的研究表明，在DRG毒性中，转基因过表达起了一定作用。在这里，本研究显示，与未表达转基因的情况相比，转基因表达与增强的炎症和抗病毒信号相关，表明转基因表达、炎症和神经毒性之间存在联系。进一步的实验将有助于阐明转基因表达在体内进一步影响胶质细胞增生的程度。

由于高AAV载体剂量引起的高VGCN诱导的DNA损伤反应，可能通过内在凋亡信号介导神经细胞丢失，同时由于细胞因子和趋化因子的释放引发局部炎症。事实上，通过p53抑制剂GSE56或下游抑制STING和IL-1R，可以在体外预防细胞死亡标志物cC3的诱导。这与先前的报告一致，即在病毒感染CNS时，以cGAS-STING依赖的方式诱导凋亡。有趣的是，最近的一项研究报告了在AAV基因转移后，被招募到肝脏的pDCs中IL-1R信号的诱导，以及其在诱导转基因特异性T细胞反应中的作用，这种反应可以通过IL-1R阻断剂Anakinra预防。尽管Kumar等人表明IL-1R信号在pDCs的背景下是相关的，但是否在组织靶细胞（如肝细胞）中也诱导了这种信号通路，以及在CNS背景下观察到的IL-1R通路的诱导，以及这些细胞中的感应器是什么，仍有待确定。

由于在体内抑制肿瘤抑制因子p53可能会引发相关的安全问题，本研究中识别的与STING抑制相关的神经保护效应为预防AAV基因治疗相关的炎症和神经毒性提供了可供测试的替代方案。此外，由于在体外难以预测损伤的持续时间，因此在开发基于短暂免疫调节的方案时，考虑这一点将非常重要。在肿瘤细胞的背景下，已经报告了IL-1信号和p53之间的联系，cGAS-STING轴与DNA损伤的联系也越来越紧密，尽管在AAV介导的CNS转导背景下，这一通路的确切触发因素仍有待定义。与体外数据一致，STING激活位于p53下游，通过抑制p53、cGAS或STING，在体内转基因沉默的AAV中，通过载体基因组感应引发信号，可以类似程度地调节转导引发的胶质细胞增生。有趣的是，最近的研究表明，在小鼠衰老过程中，cGAS-STING信号轴驱动慢性炎症和功能衰退，使用H151抑制剂可以实现神经保护效应。

尽管抑制STING和IL-1R可以减少促炎基因的表达，并足以减少hiPSC衍生的神经元和混合培养中的细胞死亡染色，但这些处理对AAV触发的I型IFN信号没有影响，而I型IFN信号似乎依赖于MAVS介导的RNA感应，这与之前在HeLa细胞中获得的结果一致。由于抗炎药物已被证明可以在人CNS的体外模型中预防神经毒性，并缓解罕见遗传性自身炎症性疾病的症状，而不会影响通常与这些病理相关的I型IFN评分，因此I型IFN激活可能在一定程度上被容忍。值得注意的是，在hiPSC衍生的星形胶质细胞中，MAVS耗竭始终导致炎症信号增强。尽管其机制基础尚待阐明，但由于MAVS的线粒体定位，MAVS耗竭可能会间接影响炎症，或者在缺乏生理RNA感应的情况下，细胞可能会被激活，从而对传入的载体产生更强的反应。

hAAT和CAG启动子之间的CpG含量差异也可能影响免疫激活的程度。先前的研究已经确定TLR9是I型IFN反应中的感应器，它识别病毒或细菌DNA中存在的未甲基化CpG序列，而不是哺乳动物DNA。然而，在本研究中，作者发现CNS细胞中的I型IFN和炎症反应依赖于不同的机制，因为TLR9阻断无法预防这些反应，与MAVS阻断对I型IFN反应或p53/STING阻断对炎症反应的影响不同。这些结果进一步表明，体外观察到的CAG和hAAT载体之间的信号差异是由于转基因的表达，这与在DRG毒性背景下报告的结果相似。

本研究的发现揭示了调节由AAV载体的先天感应引发的促炎反应的潜在靶点，并改善神经保护。进一步的机制研究将有助于阐明不同识别的核酸感应器之间的联系，并比较不同启动子在体内引发的炎症反应的强度，这将有助于阐明载体基因组感应、先天免疫激活和IFN反应对系统和IPa AAV给药后观察到的DRG神经元丢失和大脑毒性的影响。此外，还需要进一步的研究来更详细地探讨小胶质细胞对AAV介导效应的贡献，无论是体外还是体内。

总体而言，本研究揭示了病毒基因组以及转基因表达激活细胞自主反应的机制，最终导致神经元中细胞死亡途径的激活，以及随后的先天免疫反应和胶质细胞增生，并确定了可以减轻这种效应的药理策略。从机制上讲，本研究提出了一个工作模型，即传入的载体DNA首先触发依赖于p53的DNA损伤反应，随后激活cGAS/STING介导的炎症信号，从而在小鼠中促进胶质细胞增生。相反，I型IFN激活似乎主要由细胞质RNA感应驱动，这些感应汇聚到接头分子MAVS上，在这种情况下，与未表达转基因的条件相比，可能增强促炎信号。

本研究为细胞免疫的检测和少数患者的罕见临床发现（如MRI观察和高载体剂量下的DRG毒性）提供了潜在的机制联系。尽管如此，cGAS/STING和MAVS通路对载体感应的贡献将从遗传小鼠模型中的进一步确认中受益，并且进一步的研究将有助于阐明这些分子发现的临床影响，鉴于所使用的体外和体内小鼠模型的一些局限性。尽管不排除AAV载体用于治疗CNS疾病的临床应用，但本研究强调了细胞内在和先天免疫激活作为AAV免疫原性的潜在介质的相关性，并可能为改善CNS靶向AAV基因治疗的结果提供未来的免疫调节策略。

发布于：广东省